Heteromultimerisierung und Stöchiometrie heterotrimerer P2X-Rezeptoren Buchkatalog

P2X-Rezeptoren sind eine Familie von liganden-gesteuerten Kationenkanälen, welche sich bei Bindung von extrazellulärem ATP öffnen. Die sieben Isoformen (P2X1-P2X7) teilen eine gemeinsame Topologie mit zwei Transmembranregionen, einer großen extrazellulären Schleife und intrazellulären N- und C-Termini. Die Ektodomäne ist N-glykosyliert und weist fünf konservierte Disulfidbrücken auf. Mit der Ausnahme der P2X6-Isoform können sich drei Untereinheiten einer Isoform zu einem funktionellen homotrimeren Rezeptor zusammenlagern. Durch Kombination verschiedener P2X-Isoformen können sich funktionelle heterotrimere P2X-Rezeptoren ausbilden, u.a. auch mit der P2X6-Untereinheit. Homomere und heteromere P2X-Rezeptoren finden sich im gesamten Organismus sowohl in neuronalen als auch in nicht neuronalen Zellen. Dabei reichen ihre physiologischen Funktionen von der schnellen synaptischen Transmission im zentralen, peripheren und enterischen Nervensystem bis hin zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine aus Immunzellen. Ein erstes Ziel dieser Arbeit war die Überexpression des Ratten-P2X1-Rezeptors in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und anschließende Reinigung für strukturelle Analysen. Anhand eines P.pastoris-Klons, welcher die rP2X1-Untereinheit stabil exprimierte, wurden die Expressions- und Solubilisationsbedingungen für die rP2X1-Untereinheit auf maximale Ausbeute hin optimiert. Eine Induktionsdauer von 48 h bei 28°C und Einsatz von n-Dodecyl- ß-D-Maltosid als Detergenz zur Solubilisierung und Aufreinigung erwiesen sich als optimal. Deglykosylierungen ergaben, dass in P.pastoris exprimierte rP2X1-Untereinheiten nur drei NGlykane aufweisen anstelle von vier N-Glykanen, die bei Expression in X.laevis-Oozyten gefunden werden. BN-PAGE-Analyse ergab, dass in P.pastoris exprimierte rP2X1- Untereinheiten fast vollständig zu Aggregaten misassemblieren. Bei limitierter Trypsinolyse wurde in P.pastoris exprimiertes rP2X1-Protein bei relativ niedrigen Trypsin-Konzentrationen weitgehend proteolysiert, was auf eine Fehlfaltung des rP2X1-Proteins hinweist. Diese Fehlfaltung ist vermutlich ursächlich für die Missassemblierung zu rP2X1-Aggregaten. In X.laevis-Oozyten exprimiertes rP2X1-Protein zeigte im Gegensatz hierzu die bekannte trimere Assemblierung und eine relative Trypsin-Resistenz. Weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer nicht-radioaktiven Markierungsmethode zur biochemischen Analyse der Oberflächenexpression von Membranproteinen in X.laevis-Oozyten. Hierfür wurden in X.laevis-Oozyten exprimierte P2X-Rezeptoren mit dem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff Cy5-NHS-Ester kovalent an der Plasmamembran markiert, gereinigt und nach SDS-PAGE mittels Typhoon-Fluoreszenz158 Scanning im SDS-PAGE-Gel detektiert. Da der für die BN-PAGE erforderliche Coomassie- Farbstof die Cy5-Fluoreszenz vollständig auslöschte, wurde zur Sichtbarmachung Cy5- markierter Plasmamembran-ständiger P2X-Rezeptoren ein Entfärbeverfahren entwickelt, welches ein effizientes Herauslösen von Coomassie aus dem BN-PAGE-Gel nach dem Lauf ermöglichte. Auf diese Weise erwies sich die entwickelte Methode auch zur Darstellung der Quartärstruktur Plasmamembran-ständiger Proteine als geeignet. Durch Kombination der beschriebenen Fluoreszenzmarkierung mit Strep-Tactin- Affinitätschromatografie wurde die Möglichkeit geschaffen, das Heteromerisierungverhalten von P2X-Rezeptoren durch Koexpression unterschiedlicher P2X-Untereinheiten in X.laevis- Oozyten zu untersuchen. Neben bereits bekannten heteromeren P2X-Rezeptoren (rP2X1+2, rP2X1+4, rP2X1+5, rP2X1+6, rP2X2+3, rP2X2+5, rP2X2+6, rP2X4+5, rP2X4+6, rP2X3+5, rP2X5+6 und rP2X4+7) konnten erstmals die P2X-Heteromere rP2X2+4-, rP2X3+4-, rP2X3+6-, rP2X2+7-, und rP2X6+7-Rezeptoren identifiziert werden. Eingehendere Untersuchung des rP2X1+6-Heteromers mittels BN-PAGE-Analyse zeigte dessen Assemblierung zu heterotrimeren Rezeptoren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Koassemblierung der rP2X6-Untereinheit mit anderen P2X-Untereinheiten zu einer faltungsbedingten Maskierung der N-Glykane der rP2X6-Untereinheit führt, so dass sie den Golgi-Apparat in core-glykosylierter Form passiert. Außerdem werden rP2X6- Untereinheiten im heterotrimeren Komplex effizienter an die Plasmamembran transportiert. Elektrophysiologische Untersuchungen deckten einen neuen Phänotyp für das P2X1+6- Heteromer auf, welches sich durch sein nicht-desensibilisierendes Verhalten eindeutig vom rasch desensibilisierenden P2X1-Rezeptor unterscheidet, homomer exprimierte P2X6- Untereinheit selbst bilden dagegen keinen funktionsfähigen Rezeptor aus. Um die Stöchiometrie der P2X-Untereinheiten in den heterotrimeren Rezeptoren P2X1+2 und P2X2+3 zu bestimmen, wurden drei Verfahren eingesetzt: (i) Fluoreszenzdetektion selektiv mit Strep-Tactin-Chromatographie aufgereinigter, GFP-markierter P2X-Rezeptoren im BN-PAGE-Gel, (ii) Quantifizierung Cy5-markierter P2X-Untereinheit im heteromeren Rezeptorkomplex, (iii) Einzel-Molekül-Spektroskopie zur Messung der Reduktion der CFPFluoreszenzlebensdauer eines FRET-Paares aus heterotrimeren P2X1-CFP/P2X2-YFP oder P2X1-YFP/P2X2-CFP-Rezeptoren. Übereinstimmend ergab sich sowohl für das P2X1+2- Heteromer als auch das P2X2+3-Heteromer eine 2:1 Stöchiometrie aus zwei P2X1- bzw. P2X3- Untereinheiten und jeweils einer P2X2-Untereinheit. Durch Koexpression von CFP- oder YFP-fusionierten P2X1- oder P2X2-Untereinheiten in HEK293-Zellen konnte deren Kolokalisation in der Plasmamembran auch in Säugerzellen bestätigt werden.